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一步一步教你做PCR

整天谈论测序,那测序里面关键的一环是什么呢?当然是PCR了。呵呵,本次小编就写给只会做分析而不会做实验的的生物信息小伙伴们。很重要奥,所有的分析最终都要落到验证上奥!

 

一、实验原理

PCR是体外人工选择性扩增DNA的一种方法,它类似于生物体内DNA的复制。在生物体内DNA复制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs;而体外PCR反应同样需要类似的成分,有模板、引物、PCR BufferTaq酶、dNTPs。其中引物是人工设计的特定序列,实现对特定位置的扩增;PCR Buffer提供一个反应的缓冲环境;反应过程同生物体内一样,DNA双链打开,引物结合模板,延伸形成新链。而这些过程在生物体内靠DNA解旋酶解链,而在体外在通过控制反应温度实现的。如常用94℃变性模板DNA打开双链,在退火温度处引物结合到模板上,最后在72℃完成延伸,并反复重复此过程即可实现对特定片段DNA的大量扩增。到第三循环开始才产生出和靶DNA区段相同的DNA分子,进一步循环地产生出靶DNA区段的指数加倍

在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期(Plateau)会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增,达到较高水平。因此,应适当调节循环次数,在平台期前结束反应,减少非特异性产物。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

 

二、主要的成分

 

模板

1.模板可以是多种形式,主要包括基因组DNA、质粒DNA、携带病毒的基因组DNAPCR产物,cDNA等,但不能为RNA。对于不同类型的模板,其主要不同在于预变性的时间以及模板的量。一般对于大的基因组DNA预变性时间10min足够,质粒DNA2min、携带病毒的基因组DNA预变性2minPCR产物预变性2min即可。

注意cDNA为单链DNA,但仍可做PCR的模板,只不过在第一轮循环时只有一个引物结合,合成另一条链。从第二轮开始,两个引物均与特异位点结合,从而实现了与常规PCR的接轨。而同作为单链的RNA却不能进行PCR扩增,原因就在于实现PCR反应的是DNA聚合酶,只能特意识别DNA链。

2.对于模版的量来说,一般25ul体系DNA的质量为50100ng。对于基因组DNA由于其结构比较复杂,提取的浓度也往往比较大,为防止浓度过大对PCR造成影响,故需对提取的DNA进行梯度稀释。否则浓度过高则可能会引起非特异性扩增。对于质粒及PCR产物由于其结构简单,且提取浓度一般较低,则无需稀释。

 

引物

1.一般引物用贮液浓度为10uM。对于刚合成的引物可以根据期管壁上的说明计算稀释至10uM即可(一般引物说明上配制的浓度往往过高,所以必须稀释至10uM才能利用实验室最小刻度(0.5ul)的移液器取到)。另外引物一旦稀释完毕,应注意分装小份,防止在用的过程中反复冻融引物而造成引物的失效。

2.一般25ul反应中引物用量为0.5ul(终浓度要求为为0.1——1uM),若引物若放置时间比较长,则可以适当增加引物的用量。引物用量过多,容易导致引物二聚体(电泳时位于前方不成条带的小片段)的出现。

附:

1.引物稀释的方法:配制时首先将合成的引物12000r/min离心5min,室温静置1分钟,然后再慢慢打开管盖,根据引物合成单(或储存引物的离心管)说明加入一定量的灭菌水(引物说明是加入Buffer,此处加入无菌水即可)以达到10uM的浓度,在漩涡振荡器上充分振荡5-10min,即配成10um的贮存液,-20℃保存备用


PCRbuffer

一般PCR Buffer10×的,使用时终浓度应为1×。如25ul体系中,应加入10×PCR Buffer2.5ul。另外使用时应注意是否添加了Mg2+,若没有,则需要再单独添加,有则无需。

Mg2+
推荐用量为1—4mM。浓度过低,影响PCR产物的产量,而浓度过高,则出现非特性扩增。在PCR反应中Mg2+浓度,需进行优化。

三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs

避免反复冻融,应分装小份。dNTP的浓度取决于PCR反应体系中的特定靶序列的长度,常用浓度为0.2 mM。据此我们可以确定反应体系中的dNTP的最低适宜浓度。当dNTP的浓度大于50mmol/L时会抑制Taq酶的活性。需要注意的是dNTPMg2+之间的浓度关系。因为dNTP中的磷酸基团可与Mg2+结合,使反应体系中游离Mg2+浓度下降从而影响Taq 酶的活性。

Taq

PCR使用的Taq酶在反应时由于丧失3’——>5’外切核酸酶活性,因而不具有校正活性。在典型的一次PCR反应中,taq酶造成的错误的核苷酸错误的掺入率大概为每20000个核苷酸中就有一个,虽然表面上看起来不会有多大的影响,但是在分子克隆中如果有一个错误核苷酸掺入,很有可能造成移码突变,影响是严重的。为弥补taq酶这一缺点常将克隆后的序列进行测序,来确认所扩增序列的准确性。同时也可采用保真度更高的Pfu DNAPolymerase,来确保扩增的准确性,Pfu DNAPolymerase3 ’-5’的外切酶活性,5’-3’外切酶活性,是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端,不能进行Ta克隆!而解决此问题的办法是使用TaqPlus DNAPolymerase,该酶是Taq 酶和pfu Polymerase的混合物,因此既能保证准确性又能保证能够进行Ta克隆。在使用中应该注意如下问题:

 

125ul体系中一般用量为0.1ul(用枪头沾一下即可),用量过多可能会出现非特异性扩增。

2.PCR体系构建过程中最后加入的一种成分,因此只有在其他试剂加完之后才可从冰箱中取出加入。

3.Taq酶中含有甘油,故不结冰,若结冰则应丢弃。

4.对于预变性时间较长的PCR反应,应在预变性即将结束后加入酶,减少长时间高温对酶活力造成的损伤。

5.保存时间过长的酶可以适当增加用量。

 

三、体系构建

 

1.加样原则是酶最后加,倒数第二加的为模板。加样时应从离心管底部将各成分依螺旋式上升的方式加到管壁上。如果做多管PCR,那么按照如下方法计算出公共成分做n管时所需总体积然后混合均匀之后再分装到各个离心管中去,这样可以有效地避免误差及污染。

V =V×(n+1

其中V需配制的总体积V每管PCR反应需要某成分的标准体积,n表示所做PCR的管数。

2设立适当的阳性对照和阴性对照,检测PCR各试剂的可用性及污染性,便于对电泳结果准确的分析。

 

四、预实验

 

准备一个冰盒,并将做PCR的各试剂(除酶)、模板及无菌水放到冰上融化,设置PCR仪上反应程序。

 

五、实验步骤

 

下列步骤均在冰上操作

1.   1.5ml离心管,加入各公共成分(除酶)的V总,然后分装于各PCR管中,最后将酶加入。

2.   瞬时离心10s,将各成分混匀。

3.   放入PCR仪反应。

4.   4℃冰箱保存。

5.   电泳检测。

注:常用于PCRDNA聚合酶多要求反应必须冷启动,即反应必须在瞬间从低温达到变性温度(一般94℃)。但有些酶需要热启动,则无需在冰上操作,但酶同样还是需要现用现取,保持酶的最大活性。

示例 PCR反应体系(25µl)及条件如下:

质粒DNA                                    0.5µl

上游特异性PCR引物                 0.5µl

下游特异性PCR引物                 0.5µl

10×PCRbuffer                             2.5µl

Mg2+                                            1.5µl

dNTP                                            0.5µl

Taq PCR聚合酶                         0.1µl

灭菌水                                         18.9µl

 

预变性     94 2min

变性       94 30s

退火       59 30s

延伸       72 1min

循环数     30 cycles

后延伸       72 10min